CRISPR) איז אַ דריט-דור גענאָם עדיטינג טעכניק: CRISPR האט רעוואלוציאנירט די וועלט

קלאַסטערד רעגולער אינטערספּייסט קורץ פּאַלינדראָמיק ריפּיץ (CRISPR) איז אַ דריט-גענעראַציע גענאָם עדיטינג טעכניק וואָס האָט רעוואָלוציאָנירט די וועלט מיט אירע הויך-דורכפיר רעזולטאַטן. עס איז געניצט געוואָרן צו באַהאַנדלען פֿאַרשידענע ביאָלאָגישע קראַנקייטן און אינפעקציעס. פֿאַרשידענע באַקטעריעס און אַנדערע פּראָקאַריאָטן (אַזאַ ווי אַרכעאַ) האָבן אויך CRISPR/Cas9 סיסטעמען צו פֿאַרטיידיקן קעגן פאַגעס. עס איז געמאָלדן געוואָרן אַז CRISPR/Cas9-באַזירטע סטראַטעגיעס קענען פאַרהיטן דעם וואוקס און פּראָגרעס פון טריפּל נעגאַטיוו ברוסט ראַק (TNBC) דורך צילן פּאָטענציעל געביטן קעגנשטעל גענעס, טראַנסקריפּציע און עפּיגענעטיש רעגולאַציע. די טעראַפּעווטישע ינטערווענטשאַנז קענען העלפֿן אַדרעסירן שווערע פּראָבלעמען אַזאַ ווי מעדיצין קעגנשטעל באמערקט אפילו אין TNBC. איצט, פֿאַרשידענע מעטאָדן ווערן געניצט צו צושטעלן CRISPR/Cas9 צו ציל סעלז, אַזאַ ווי גשמיות (מיקראָינדזשעקשאַן, עלעקטראָפּאָראַטיאָן און הידראָדינאַמיק מאָדעס), וויראַל (אַדענאָ-אַססאָסיאַטעד ווירוס און לענטיווירוס) און ניט-וויראַל (ליפּאָסאָמעס און ליפּיד נאַנאָפּאַרטיקלעס). כאָטש פֿאַרשידענע מאָדעלן זענען דעוועלאָפּעד געוואָרן צו שטודירן די מאָלעקולאַרע סיבות פֿון TNBC, באַגרענעצט דער מאַנגל פֿון סענסיטיווע און צילגעריכטע מעטאָדן פֿאַר צושטעלן גענאָם רעדאַקטירן מכשירים אין וויוואָ זייער קלינישע אַפּליקאַציע. אין קורצן, דאָס איבערבליק אונטערזוכט קאָמפּרעהענסיוו די פּראָגרעס, טשאַלאַנדזשיז, באַגרענעצונגען און פּראַספּעקטן פֿון CRISPR/Cas9 באַהאַנדלונג פֿאַר TNBC באַזירט אויף עקזיסטירנדיקע באַווייַזן. מיר אונטערשטרייַכן אויך ווי די קאָמבינאַציע פֿון קינסטלעכער אינטעליגענץ און מאַשין לערנען קען פֿאַרבעסערן CRISPR/Cas9 סטראַטעגיעס אין דער באַהאַנדלונג פֿון TNBC.
קענסער ווערט כאַראַקטעריזירט דורך אַנקאַנטראָלירטע צעל טיילונג, דיסראַפּשאַן פון צעל ציקל טשעקפּוינטס, און מוטאַציעס אין טומאָר סאַפּרעסער גענעס (TSGs) (Matthews et al., 2022). צווישן די פאַרשידענע טייפּס פון קענסער, ברוסט קענסער איז די מערסט פּראָסט טיפּ פון קענסער אין פרויען און האט אַ הויך מאָרטאַליטי קורס ווערלדווייד (Waks און Winer, 2019). ברוסט קענסער איז אַ העטעראָגענע קראַנקייט מיט פאַרשידענע קעראַקטעריסטיקס, אַזאַ ווי היסטאָלאָגישע און ביאָלאָגישע פֿעיִקייטן, קליניש פּרעזענטירונג און נאַטור, און ענטפער צו באַהאַנדלונג (Weigelt et al., 2010). ברוסט קענסער קלאַסיפיקאַציע גיט פּינטלעך ינסייץ פֿאַר ברוסט קענסער דיאַגנאָז און טומאָר פּראָגנאָסיס. די נוצן פון פּראָסט ביאָמאַרקערס און קליניקאָפּאַטהאָלאָגישע פֿעיִקייטן איז געווען די הויפּט קריטעריאָן פֿאַר די קלאַסיפיקאַציע פון ​​ברוסט קענסער (Tsang און Tse, 2019). די פּראָגנאָסיס און ענטפער צו באַהאַנדלונג פון ברוסט קענסער איז ינפלוענסט דורך פילע סיבות, אַרייַנגערעכנט די בייַזייַן פון עסטראָגען רעסעפּטאָר (ER), פּראָגעסטעראָן רעסעפּטאָר (PR), מענטשלעך עפּידערמאַל גראָוט פאַקטאָר רעסעפּטאָר 2 (HER2/neu), און היסטאָלאָגישע גראַד, טומאָר טיפּ, און גראַד. גרייס און לימף נאָד מעטאַסטאַסיס (אַל-טובאַיטי, 2020). פינף אינטרינסיק מאָלעקולאַר סובטיפּעס פון ברוסט ראַק זענען געוואָרן אידענטיפיצירט, אַרייַנגערעכנט לומינאַל A, לומינאַל B, HER2-ענריטשט, באַסאַל-ווי, און קלאַודין-נידעריק (פּראַט עט על., 2015). TNBC איז אַ מאָלעקולאַר סובטיפּ פון ראַק וואָס אויסדריקט נישט אַלע ER, PR, און HER2 (יין עט על., 2020). די פּאַטאַלאַדזשיקאַל פֿעיִקייטן זענען פֿאַרבונדן מיט TNBC, באַשטעטיקן זיין שנעל פּראָגרעס און מער אַגרעסיוו נאַטור ווי קיין אנדערע טיפּ פון ברוסט ראַק (פֿענג עט על., 2018). אין דערצו, פּערו עט על (2000) האָבן גענוצט מיקראָאַרריי טעכנאָלאָגיע צו רעקלאַסיפיצירן ברוסט ראַק און אידענטיפיצירן פינף אינטרינסיק סובטיפּעס פון ברוסט ראַק (קאַדענאַס, 2012). באַסאַל-ווי ברוסט ראַק איז אַ סובטיפּ פון ברוסט ראַק וואָס האט אַ טריפּל-נעגאַטיוו פענאָטיפּ און איז פֿאַרבונדן מיט שנעל פּראָגרעס. עס איז וויכטיג צו באַמערקן אַז אַלע באַסאַל-ווי ברוסט ראַק זענען אָפט פאַלש דיאַגנאָסעד ווי TNBC, אָבער בלויז 77% זענען TNBC; אין קאַנטראַסט, 71-91% פון TNBC זענען באַסאַל-ווי, וואָס ינדיקייץ אַז די צוויי טייפּס פון ברוסט ראַק אָוווערלאַפּ און רעפּרעזענטירן פאַרשידענע קלאַסאַפאַקיישאַנז (וואַנג ד.-י. עט אַל., 2019). דאָס שאַפט אַ נויט צו כאַראַקטערייזירן די העטעראָגעניטי פון TNBC צו דערקלערן פּראָגנאָז און ידענטיפיצירן פּאָטענציעלע רעאַקציעס צו קראַנט און צוקונפֿט באַהאַנדלונגען. דערצו, TNBC אַקאַונץ פֿאַר 15-20% פון אַלע ברוסט ראַק קאַסעס און איז מער פּראָסט אין פרויען אונטער 50 יאָר אַלט. BRCA1 אָדער BRCA2 מוטאַציעס זענען געמאלדן געוואָרן אין בעערעך 20% פון TNBC קאַסעס (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). שטודיעס האבן אויך געוויזן אז TNBC האט א באזונדערע אימונע מיקרא-סביבה וואס נעמט אריין הויכע לעוועלס פון וואסקולערע ענדאטעליאלע וואוקס פאקטארן, טומאר-פארבונדענע מאקראפאגעס (TAMs), טומאר-אינפילטרירנדע לימפאזיטן (TILs), און אנדערע מאלעקולן וואס זענען פארמישט אין טומאר וואוקס און מיגראציע. דעריבער, פארשטיין די מיקרא-סביבה פון TNBC איז קריטיש פאר איר פראגנאז און באהאנדלונג (Fan און He, 2022).
כדי צו אפשאצן די פראגנאז פון TNBC און זיכער מאכן עפעקטיווע באהאנדלונג, איז וויכטיג א גענויע דיאגנאז, בעיקר באזירט אויף אימונאכיסטאכעמיע (IHC) צו דעטעקטירן ER, PR און HER2, און מאמאגראפיע צו דעטעקטירן ברוסט נעאפלאזמען. אבער, מאמאגראפיע קען נישט גענוג אויפווייזן אינטראטומאראלע אייגנשאפטן ווי נעקראזיס און פיבראזיס (דיפאק סינגה עט אל., 2021). זינט א שלעכטע פראגנאז און דיאגנאז פארמיידן דאקטוירים פון פארשרייבן די ריכטיגע מעדיקאציעס (טשאודהארי, 2020), ווערן פארשידענע סטראטעגיעס גענוצט צו פארבעסערן די באהאנדלונג פאר פאציענטן מיט TNBC. איצט ווערן צוויי מעדיצינען, דאקסארוביצין און ציקלאפאספאמיד, גענוצט ביי פאציענטן מיט TNBC און האבן געוויזן גוטע רעזולטאטן. דערצו ווערן אנדערע פלאטינום מעדיצינען גענוצט, ווי קארבאפלאטין און ציספלאטין (סיקאוו עט אל., 2015). דערצו זענען PARP אינהיביטארן ווי אולאפאריב, וועלאפאריב, און PF-01367338 גענוצט געווארן אלס מעגלעכע כעמאטעראפיע מעדיצינען פאר דער באהאנדלונג פון TNBC (אישינא עט אל., 2018). זינט מען האט געמאלדן אז Wnt/b-Catenin, NOTCH, און Hedgehog סיגנאלינג וועגן זענען פארמישט אין דעם אויפטרעטן און פארשריט פון TNBC, קען צילן מעדיצינען צו די וועגן זיין א וויכטיגע סטראטעגיע (Aysola et al., 2013). כאטש כירורגיע, ראדיאציע טעראפיע און כעמאטעראפיע בלייבן די הויפט באהאנדלונג פאר TNBC היינט, איז געמאכט געווארן באדייטנדע פארשריט אין אנטוויקלען נייע באהאנדלונגען, אריינגערעכנט צילגעריכטעטע טעראפיע, אימונאטעראפיע, פארשידענע CRISPR-פארבונדענע גען עדיטינג מכשירים ווי Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, פריים עדיטינג, און CRISPR/Cas9-געצילטע גען טעראפיע. דא וועלן מיר זיך קאנצענטרירן אויף פארשידענע CRISPR-פארבונדענע גען עדיטינג מכשירים גענוצט אין דער באהאנדלונג פון TNBC. צווישן זיי, האט CRISPR/Cas9 באקומען ברייטע אויפמערקזאמקייט.
Cas9n, אויך באקאנט אלס Cas9 ניקאַסע, איז א גענעטיש אינזשענירטע וואַריאַנט פון דעם Cas9 פּראָטעין וואָס שטאַמט פון דעם CRISPR/Cas9 גענאָם עדיטינג סיסטעם (Gupta et al., 2019). אין זיין אָריגינעלער פאָרעם, אנטהאלט דער Cas9 פּראָטעין צוויי נוקלעאַזע דאָמעינען: RuvC און HNH, וועמענס הויפּט פונקציע איז די שפּאַלטונג פון ביידע DNA סטראַנדז. אָבער, אין Cas9n, ווערט איינער פון די נוקלעאַזע דאָמעינען, HNH, גענעטיש מוטירט און ווערט אינאַקטיוו. דעריבער, בלייבט דער HNH דאָמעין פון Cas9n נישט פונקציאָנעל. נאָר דער RuvC דאָמעין בלייבט אַקטיוו, וואָס ערלויבט Cas9n צו שניידן אָדער שאַפֿן ברייקס אויף איין DNA סטראַנדז (Trevino און Zhang, 2014). קאַמפּערד מיט Cas9, קען Cas9n עפעקטיוו רעדוצירן אָף-ציל עפֿעקטן און פּינקטלעך פֿאַרבעסערן צעל רעפּאַר מעקאַניזמען. Cas9n קען ווערן גענוצט צו סאָלווען פֿאַרשידענע פּראָבלעמען, אַזאַ ווי שאַפֿן ברייקס אין ספּעציפֿישע לאָקאַציעס אין טאָפּל-שטראַנדעד DNA. פֿאַר דעם צוועק, זענען צוויי Cas9n מאָלעקולן קאָמבינירט און גענוצט צוזאַמען (Yee, 2016). געמישט ליניאַדזש קינאַסע 3 (MLK3) איז אַ מיטאָגען-אַקטיווייטיד פּראָטעין קינאַסע וואָס דינט ווי אַ שליסל רעגולאַטאָר בעשאַס TNBC מעטאַסטאַסיס (קראָנאַן עט על., 2012).
MLK3 קען אַקטיווירן קייפל סיגנאַלינג פּאַטווייז וואָס פירן צו TNBC מעטאַסטאַסיס. למשל, דער c-Jun N-טערמינאַל קינאַזע (JNK) פּאַטוויי רעגולירט צעל מאָטיליטי און עקסטראַסעלולאַר מאַטריץ דעגראַדאַציע, און MLK3 אַקטיווירט דעם JNK פּאַטוויי, דערמיט פֿאַרבעסערנדיק צעל מאָטיליטי און גיט ינווייסיוו פּראָפּערטיעס (Rattanasinchai און Gallo, 2016). MLK3 רעגולירט אויך EMT. צו טאָן דאָס, אַקטיווירט עס דאַונסטרים טראַנסקריפּציע פאַקטאָרן ווי Snail, Slug און Twist. די פאַקטאָרן פאַרהיטן די אויסדרוק פון עפּיטעליאַל מאַרקערס און העכערן די אויסדרוק פון מעזענטשימאַל מאַרקערס, וואָס פירט צו דער אַקווייזישאַן פון אַ מעטאַסטאַטיק פענאָטיפּ (Casalino et al., 2023). MLK3 איז באמערקט צו שפּילן אַ ראָלע אין ECM רימאָדעלינג און אַקטיוואַציע פון ​​פּראָטעאַסעס ווי מאַטריץ מעטאַלאָפּראָטעינאַסעס (MMPs) וואָס דעגראַדירן די ECM. דאָס פאַסילאַטייץ טומאָר צעל ינוואַזיע און פאַרשפּרייטן צו ווייַט זייטלעך (Katari et al., 2019). אַזוי, פריערדיקע שטודיעס האָבן געוויזן אַז MLK3 שפּילט אַ קריטיש ראָלע אין TNBC. ראַטאַנאַסינטשיי און גאַלאָ האָבן גענוצט TNBC מאָדעלן צו שטודירן די ראָלע פון ​​MLK3 און געפֿונען אַז עס פּראָמאָטירט ראַק אַנטוויקלונג דורך ספּעציפֿישע סיגנאַלינג פּאַטווייז. זיי האָבן גענוצט CRISPR/Cas9n צו רעדאַקטירן MLK3 און באמערקט אַ באַטייטיק רעדוקציע אין TNBC מעטאַסטאַסיס (ראַטטאַנאַסינטשיי און גאַלאָ, 2016).
dCas9, אָפט גערופן אינאַקטיוו Cas9, איז אַ מאָדיפיצירטע דעריוואַטיוו פאָרעם פון די Cas9 פּראָטעין. ניט ווי אַקטיוו Cas9, dCas9 פעלט ענדאָנוקלעאַזע טעטיקייט, מאַכנדיג עס ניט ביכולת צו פאַראורזאַכן DNA טאָפּל-שטראַנד ברייקס. דעריבער, dCas9 קען ווערן גענוצט צו פּינקטלעך צילן ספּעציפֿישע געגנטן פון די גענאָם אָן קיין ענדערונגען אָדער מאָדיפיקאַטיאָנס צו די DNA סיקוואַנס (Wang et al., 2016). אין dCas9, צוויי ענדאָנוקלעאַזע פּראָטעאינען, RuvC און HNH, ווערן ינאַקטיווייטיד דורך סאַפּרעסינג וויכטיק אַמינאָ זויער רעזאַדוז. (Richter et al., 2016). טראָץ זיין מאַנגל פון DNA שפּאַלטונג טעטיקייט, dCas9 שפּילט אַ נומער פון וויכטיקע ראָלעס אין גענעטישע פאָרשונג און ביאָטעכנאָלאָגיע. למשל, עס אַלאַוז וויזשוואַלאַזיישאַן פון ספּעציפֿישע געגנטן פון די גענאָם, פאַסילאַטייץ טראַנסקריפּשאַנאַל רעגולאַציע, און פּראַמאָוץ עפּיגענעטיק מאָדיפיקאַטיאָנס (Brocken et al., 2018).
דער טראַנסקריפּציע פאַקטאָר ZEB1 (צינק פינגער E-באָקס ביינדינג האָמעאָבאַקס 1) שפּילט אַ ספּעציפֿישע און קריטישע ראָלע אין מעדיאַטינג עפּיטעליאַל-מעסענטשימאַל טראַנזישאַן (EMT), אַ צעלולאַרע פּראָצעס וואָס פּאַסירט בעת עמבריאָניק אַנטוויקלונג, געוועב ריפּער, און ראַק פּראָגרעס. עס ינוואַלווז די טראַנספאָרמאַציע פון ​​עפּיטעליאַל סעלז אין מעסענטשימאַל סעלז, ריזאַלטינג אין ענדערונגען אין צעל מאָרפאָלאָגי, מאָטיליטי, ינווייסיוונאַס, עטק. (ווו עט על., 2020). ZEB1 ינכיבאַץ קייפל עפּיטעליאַל מאַרקערס, אַזאַ ווי E-cadherin און אָקקלודין, וואָס זענען פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר מיינטיינינג צעל-צעל אַדכיזשאַן און פּאָלאַריטי פון עפּיטעליאַל סעלז אין TNBC (מאָרענאָ-בוענאָ עט על., 2008). אין דערצו, ZEB1 אַקטיוויז זיכער מאַרקערס אַזאַ ווי N-cadherin, ווימענטין און פיבראָנעקטין (קאָנראַדי עט על., 2014) און אויך רעגיאַלייץ גענעס ינוואַלווד אין סיטאָסקעלעטאַל רימאָדעלינג אַזאַ ווי Rho GTPases און מאַטריץ מעטאַלאָפּראָטעינאַסעס (MMPs) (הואַנג). עט על., 2014). 2022), דערצו, עס ווירקט אויך אויף פארשידענע סיגנאלינג וועגן ווי טראנספארמירנד גראָוט פאַקטאָר-β (TGF-β), Wnt סיגנאלינג, אאז"וו, דערמיט פראָמאָדירנד טומאָר ינוואַזיע און מעטאַסטאַסיס אין TNBC (טשען עט על., 2016). פילע שטודיעס און וויסנשאפטלעכע באַווייַזן ווייַזן אַז ZEB1 האט גרויס פּאָטענציעל ווי אַ ווערטפול אַגענט פֿאַר די דעטעקציע און טעראַפּיוטיק ינטערווענטיאָן פון TNBC. אין אַ לעצטער שטודיע, וואַריאַה עט על. האָבן גענוצט אַ TNBC מאָדעל און דערגרייכט גאַנץ סאַפּרעשאַן פון ZEB1 דורך dCas9. אזוי, זיי האָבן באמערקט זייער הויך ספּעציפֿישקייט און כּמעט גאַנץ ינכיבישאַן פון ZEB1 אין אין וויוואָ באדינגונגען (וואַריאַה עט על., 2023).
CRISPR/Cas12 איז א גען עדיטינג געצייג גערופן CRISPR/Cpf1. עס שטאמט פון די CRISPR/Cas סיסטעם, וואו דער טערמין Cas12 באציט זיך צו CRISPR-פארבונדענע פראטעין 12 (Bharathkumar et al., 2022), וואס איז אינגאנצן ענליך צו Cas9. דער איינציגער אונטערשייד איז אז עס אנטהאלט דעם Cas12 פראטעין. אין פארגלייך מיט Cas9, האט Cas12 עטליכע אייגנארטיגע פונקציעס ווי למשל שאפן קלעפּיקע ענדס בעת דעם גען עדיטינג פראצעס, משא"כ Cas9 שאפן בלאנטע ענדס (Wang et al., 2021). די אייגנשאפט פון Cas12 ביישטייערט צו זיין ספעציפישע DNA מאניפולאציע טעכנאלאגיע. אלס א פראטעין וואס איז פעאיג צו גענוי דערקענען און שניידן ציל DNA, האט עס אויסערגעווענליכע ווערסאטילעטי, מאכנדיג עס אן עפעקטיוו געצייג פאר א פארשיידנקייט פון אנווענדונגען, אריינגערעכנט גען עדיטינג (Pickar-Oliver און Gersbach, 2019).
ענלעך צו אנדערע CRISPR וואריאנטן, איז CRISPR/Cas12 אויך פעאיק אויסצושלאָגן אדער אקטיוויזירן גענעס אין TNBC, צילנדיק גענעס וואס שפילן א וויכטיגע ראלע אין זיין פּאַטאָגענעזיס אדער רעאקציע צו באַהאַנדלונג (יאַנג און זשאַנג, 2023). צו דערגרייכן דעם פּראָצעס, איז אַ גייד RNA (gRNA) דעוועלאָפּט געוואָרן וואָס ריכט Cas12 צום ציל גען. אַמאָל Cas12 בינדט זיך צו זיין ציל, פירט עס איין טאָפּל-שטראַנד ברייקס אין DNA און אקטיוויזירט DNA פאַרריכטן מעקאַניזמען. בעת דעם פאַרריכטן פּראָצעס, קענען אומרעכטע נוקלעאָטידן ווערן איינגעבויט, וואָס פירט צו גען מוטאַציעס און פארלוסט פון פונקציע (זשאַנג עט על., 2021אַ). אין דערצו, איז אַ פֿאַרבעסערטע ווערסיע פון ​​דעם Cas12 ענזיים (גערופן dCas12) אויך געניצט געוואָרן צו אקטיוויזירן גענעס. דורך עס צו קאָמבינירן מיט אַ טראַנסקריפּציע אַקטיוואַטאָר, איז מעגלעך צו אינדוצירן געוויסע גענעס, דערמיט אקטיוויזירן זיי. די טעכנאָלאָגיע האט גרויס פּאָטענציעל אין פּראָמאָטירן די אקטיוויזאַציע פון ​​טומאָר סאַפּרעססאָר גענעס (סולטאַן עט על., 2022).
פּריים עדיטינג איז אַ נײַ־אַנטוויקלטע און גאָר העכערע גענאָם עדיטינג טעכנאָלאָגיע. עס איז פֿעיִק צו מאָדיפֿיצירן די דנאַ פֿון אַן אָרגאַניזם זייער פּינקטלעך (טשען און ליו, 2023). פּריים עדיטינג ווערט דערגרייכט דורך דער אינטעגראַציע פֿון צוויי הויפּט קאָמפּאָנענטן: אַ מאָדיפֿיצירטער CRISPR/Cas9 ענזיים און ריווערס טראַנסקריפּטאַז. די ראָלע פֿון דעם CRISPR/Cas9 ענזיים איז צו סעלעקטיוו צילן פּינקטלעכע ערטער אין גענאָם, בשעת ריווערס טראַנסקריפּטאַז העלפֿט גרינטלעך מאָדיפֿיצירן די דנאַ בײַ דער ציל־אָרט (האַסן עט אַל., 2021). אין דעם פּריימער עדיטינג מעקאַניזם, באַשטייט דער ערשטער שריט פֿון דער שאַפֿונג פֿון אַ פּריימער עדיטינג גייד RNA (pegRNA) (סטאַנדאַדזש־בעיער עט אַל., 2021). עס כּולל די ציל־סעקווענץ און RNA טעמפּלאַט וואָס קאָרעספּאָנדירט צו דער געוואונטשער עדיטינג־אָרט אין דער ציל־DNA. די pegRNA ווערט דאַן אײַנגעפֿירט אין ציל־צעלן צוזאַמען מיט אַ פּריימער עדיטינג נוקלעאַז (PE2). PE2 איז אַ פֿוזשאַן פּראָטעין וואָס באַשטייט פֿון אַ Cas9 ענזיים, אַ ריווערס טראַנסקריפּטאַז, און אַ פּריימער עדיטינג אַדאַפּטער (מאַרטין־אַלאָנסאָ עט אַל., 2021). אינעווייניק פון דער צעל, זוכן pegRNA און PE2 קאָמפּלעקסן די ספּעציפֿישע DNA וואָס זיי ווילן מאָדיפֿיצירן. דער Cas9 ענזיים שניידט DNA און שאַפֿט אַ טעמפּלאַט באַשטייענדיק פֿון איין-שטראַנדן (Choi et al., 2022). רעווערס טראַנסקריפּטאַז ניצט דעם טעמפּלאַט צו צוגרייטן די DNA פֿאַר רעדאַקטירן. צוזאַמען מיטן קאָפּירן DNA, זענען אויך אַרייַנגערעכנט אינסטרוקציעס פֿאַר רעדאַקטירן די RNA טעמפּלאַט. צום סוף, ווערט דער ניי-געשאַפענער DNA סטראַנד געניצט ווי אַ טעמפּלאַט צו פאַרריכטן דעם בראָך אין דער DNA, וואָס רעזולטירט אין אַ געביטן DNA סיקוואַנס וואָס כּולל די געוואונטשענע מאָדיפֿיקאַציע (Ochoa-Sanchez et al., 2021). פּריימער רעדאַקטירן מעקאַניזמען קענען פֿירן צו ברייטע מוטאַציעס אין גענעס. עס קען צילן פּונקט מוטאַציעס, ינסערשאַנז, דילעשאַנז, און אפילו גענע ריפּלייסמאַנץ (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). פּריים רעדאַקטירן אָפפערס עטלעכע אַדוואַנטאַגעס איבער פֿריִערדיקע גענאָם רעדאַקטירן טעקנאַלאַדזשיז. די אַרייַננעמען געוואקסענע אַקיעראַסי, רידוסט אָף-טאַרגעט יפעקץ, און די מעגלעכקייט צו רעדאַקטירן DNA אָן זיך פֿאַרלאָזן אויף DNA טאָפּל-שטראַנד ברעאַקס (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 טעכנאָלאָגיע איז אָריגינעל דעוועלאָפּעד געוואָרן צו באַשיצן באַקטעריע פון ​​פּלאַזמיד טראַנספער און פאַגע ינפעקציע און איז שפּעטער ווידער געניצט געוואָרן ווי אַן עפעקטיוו RNA-באַזירט DNA טאַרגעטינג געצייַג פֿאַר גענאָם עדיטינג (דזשיאַנג און דודנאַ, 2017). אין דערצו, די CRISPR/Cas9 סיסטעם איז געמאלדן צו זיין פאָרשטעלן אין 50% און 87% פון באַקטעריעלע און אַרכעאַל גענאָמעס, ריספּעקטיוולי (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 איז אַ פּאָטענציעל געצייַג פֿאַר דילישאַן, ינסערשאַן און קערעקשאַן פון קיין אַבנאָרמאַל גענעטישע סיקוואַנס ניצן אין וויוואָ און אין וויטראָ מאָדעס (Sabit et al., 2021). דערצו, CRISPR/Cas9 איז געוויזן צו זיין טייל פון די אַדאַפּטיוו ימיון סיסטעם רעכט צו זיין ספּעסיפיסיטי פֿאַר ציל גענעס פון אינטערעס (Chen און Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 באשטייט פון Cas9 און אן איינציקע גייד RNA (sgRNA). Cas9 איז אן ענדאנוקלעאז צוזאמענגעשטעלט פון פארשידענע פראטעין קאמפאנענטן. דערצו, האט Cas9 אייגנארטיגע סטרוקטורעלע און קאנפארמאציאנעלע אייגנשאפטן (Pacesa et al., 2022) ווייל עס באשטייט פון צוויי לאבעס: דערקענונג (REC) און נוקלעאז (NUC). די REC לאבע איז ווייטער צעטיילט אין דריי ראיאנען: REC1, REC2, און בריק העליקס (Cromwell et al., 2018). די NUC באשטייט פון דריי לאבעס, נעמליך RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH און די פראטאספייסער אדגעיסענט מאטיוו (PAM) אינטעראקציע דאמעין (פיגור 1) (Song et al., 2016). sgRNA באשטייט פון צוויי קאמפאנענטן, אריינגערעכנט CRISPR RNA (crRNA) און טראנסקאדירן קליין RNA (טרייסער RNA) (פיגור 1). די sgRNA פארבינדט דעם Cas9 פּראָטעין צו קאָנעקסינס צו שאַפֿן אַן אַקטיוון קאָמפּלעקס, אויך באַקאַנט ווי דער עפֿעקטאָר קאָמפּלעקס (Richter et al., 2012). crRNA איז אַ 18-20 נוקלעאָטיד באַזע פּאָר וואָס שפּילט אַ קריטישע ראָלע אין דערקענען ציל DNA סיקוואַנסן. אין דערצו, crRNA פּאָר זיך מיט דער ציל DNA, און tracrRNA אַקט ווי אַ סקאַפאָולד פֿאַר די Cas9 נוקלעאַזע צו בינדן די ציל DNA (Manghwar et al., 2019). אויף דער אַנדערער האַנט, די PAM סיקוואַנס האט 3 נוקלעאָטידן, וואָס באַשטעטיקט, ספּעציפֿיצירט און מעדיאַטירט די בינדונג פון דעם עפֿעקטאָר קאָמפּלעקס צו DNA. די Cas9 פּראָטעין קאָמפּלעקס סובוניץ RuvC און HNH האָבן קאַטאַליטישע טעטיקייט (Richter et al., 2012; Asmamaw און Zawdie, 2021). די HNH נוקלעאַזע דאָמעין פון די Cas9 סובוניט שפּאַלט דעם DNA סטראַנד פֿאַרבונדן מיט די crRNA. די RuvC נוקלעאזע דאמעין שפּאַלט אַנדערע דנ״א סטראַנדז און דזשענערירט טאָפּל-שטראַנד ברעאַקס (DSBs), נאָכדעם ווערן צוויי פֿאַרשידענע דנ״א ברעאַק רעפּאַר מעקאַניזמען אַקטיוויזירט (דזשיאַנג און דאָודנאַ, 2017) (פֿיגור 1).
פיגור 1. איבערבליק פון CRISPR/Cas9 (A). קאמפאנענטן פון די CRISPR/Cas9 סיסטעם: (i). Cas9 ענדאנוקלעאז איז פאראנטווארטלעך פארן שניידן די ציל DNA סיקווענס, (ii) אן איינציקע גייד (sg) RNA רעזולטאט פון די פיוזשאן פון crRNA און tra-crRNA כימעראס. (צוויי). Cas9 שליסט איין עטלעכע קאמפאנענטן ווי Rec I, Rec II, NUC לאב (HNH און Ruv C זענען סובקאמפאנענטן) און PAM אינטעראקציע דאמעין (C) מיט קארעספאנדירנדע פונקציעס. דער CRISPR/Cas9 פראטעין קאמפלעקס צעטיילט DNA סיקווענצן אין נישט-קאמפלעמענטארע און קאמפלעמענטארע פארמען (D). CRISPR/Cas9 רעדאקטירט דעם גענאם אין דריי שטאפלען: דערקענונג, שניידן און פאררעכטן. די דיזיינטע sg-RNA גיידט Cas9 און דערקענט די געוואונטשענע סיקווענס דורך די קאמפלעמענטארע קאמפאנענט crRNA. Cas9 דערקענט די PAM סיקווענס ביי 5′-NGG-3′ און צעשמעלצט די DNA, פארמירנדיג א DNA-RNA כייבריד און אקטיווירנדיג צעשפּאַלטונג. דער HNH דאמעין פון Cas9 צעשפּאַלט דעם קאָמפּלעמענטאַרן שטראַנד, און דער RuvC דאמעין צעשפּאַלט דעם נישט-קאָמפּלעמענטאַרן שטראַנד. CRISPR/Cas9 רעפּאַרירט טאָפּל-שטראַנדעד DNA דורך עס צעברעכן אין צוויי וועגן: נישט-האָמאָלאָגישע ענד דזשוינינג (NHEJ) און האָמאָלאָגיע-דירעקטעד רעפּאַר (HDR). NHEJ רעפּאַרירט טאָפּל-שטראַנדעד DNA אין דער אַוועק פון פרעמדער האָמאָלאָגישער DNA דורך אַן ענזימאַטישן פּראָצעס, אַ מעханіזם וואָס איז פּראָנע צו טעותים און קען אַריינשטעלן אָדער אַראָפּנעמען ראַנדאָמע DNA סיקוואַנסן. HDR איז זייער ספּעציפֿיש און דאַרף האָמאָלאָגישע DNA טעמפּלאַטן.
CRISPR/Cas9-געפירטע רעפּאַראַציע פּאַטווייז אַרייַננעמען ניט-האָמאָלאָגאָוס ענד דזשוינינג (NHEJ) און כאָומאָלאָגי-דירעקטעד רעפּאַר (HDR) מעקאַניזמען. NHEJ איז אַ טעות-פּראָון פּאַט ווייַל עס ינוואַלווז ינסערשאַן אָדער דילישאַן און ריקווייערז נישט קיין מוסטער בעשאַס די רעפּאַראַציע מעקאַניזאַם. עס ניצט ראַנדאָם נוקלעאָטידן צו דזשענערייט נאָרמאַל פּראָטעינס (אַבבאַסי עט על., 2021). די רעפּאַראַציע סיסטעם באשטייט פון פיר קאָמפּלעקסן אַזאַ ווי די KU קאָמפּלעקס, די קראָס-קאַמפּלאַמענטינג פּראָטעין קאָמפּלעקס טיפּ 4 (XRCC-4), די DNA ענד פּראַסעסינג ענזיים, און די פּראָטעין קינאַזע DNA-PKcs (אַבבאַסי עט על., 2021). דער KU קאָמפּלעקס פּראָטעין האט צוויי סוביוניטן, Ku 70 און Ku 80, און שפּילט אַ וויכטיקע ראָלע אין דעם NHEJ מעханіזם, ווײַל דער רעפּאַראַטור מעханіזם ווערט איניציאירט דורך דער בינדונג פון צוויי סוביוניטן (Ku 70 און Ku 80) צו די שטומפּע אָדער כּמעט שטומפּע ענדס פון דער ציל DNA (Abbassi et al., 2021), און דינט ווי אַ סקאַפאָולד צו רעקרוטירן אַנדערע NHEJ-פֿאַרבונדענע פֿאַקטאָרן צו דער אָרט פון שאָדן (Yang et al., 2020). XRCC-4 און DNA ליגאַסע זענען צוזאַמענגעשטעלט פון 334 און 911 אַמינאָ זויערן, ריספּעקטיוולי, און דער XRCC4-DNA ליגאַסע IV קאָמפּלעקס סטימולירט ליגאַציע פון ​​DNA ענדס (Chatterjee et al., 2015). DNA ענד פּראַסעסינג ענזיים, אויך באַקאַנט ווי פּאָלינוקלעאָטיד קינאַזע 3′-פאָספאַט, איז אַ DNA ענד פּראַסעסינג ענזיים. עס קען אַראָפּנעמען די 3′P גרופּע אין DNA און פאָספאָרילירן די 5′OH גרופּע בעת DSB רעפּאַראַטור. עס נעמט אויך אריין די פארריכטונג פון איינצעל-שטראנג ברייקס (SSBs) ניצנדיג דעם SSB פארריכטונג וועג (Chatterjee et al., 2015). פראטעין קינאַזע DNA-PKcs איז א DNA-אפהענגיקע פראטעין קינאַזע וואס באשטייט פון א קאטאליטישע סוביוניט פון די PIKKs (פאספאטידילינאזיטאל 3-קינאַזע-פארבונדענע קינאַזעס) און אטאקסיע טעלאנגיעקטאזיע מוטירט (ATM) פאמיליע, ווי אויך ATM און ראד3-פארבונדענע ATRs, סטראנד ברייקס (DSBs) און איינצעל-שטראנג ברייקס (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR איז אַ מער פּינקטלעכער און פּאַסיקער רעפּאַראַציע מעханіזם ווײַל די אינפֿאָרמאַציע ווערט קאָפּירט ניצנדיק די גאַנצע פֿאָרעם פֿון דעם האָמאָלאָגישן DNA דופּלעקס, כאָטש עס פֿאָדערט די בייַזײַן פֿון שוועסטער כראָמאַטידן. דאָס פּאַסירט בעת דער S/G2 פֿאַזע פֿון דעם זויגערס צעל ציקל. HDR פּאַסירט דער עיקר אין הייוון מינים, אָבער NHEJ איז קריטיש אין זויגערס (בורמאַ עט אַל., 2006; אַבבאַסי עט אַל., 2021). דער גאַנצער רעפּאַראַציע מעханіזם ווערט געוויזן אין פֿיגור 1.
זינט TNBC ווערט געפֿירט דורך גענעטישע און עפּיגענעטישע אַבנאָרמאַליטעטן, קען קאָרעקציע פֿון בייזאַרטיקע גענאָמישע/עפּיגענאָמישע אַבנאָרמאַליטעטן מיט CRISPR/Cas9 זײַן אַ גלייַכגעוויכטיקער טעראַפּעווטישער צוגאַנג (Chen et al., 2019). דערצו, קענען עטלעכע טראַנסקריפּציע פֿאַקטאָרן וואָס זענען פֿאַרבונדן מיט צעל-ספּעציפֿישע טראַנסקריפּציאָנעלע רעגולאַציע ווײַזן אײַנציקאַרטיקע כאַראַקטעריסטיקס פֿון ראַק צעלן, וואָס סאַגדזשעסטירט אַז טראַנסקריפּציאָנעלע רעגולאַציע קען זײַן אַן אויסגעצייכנטער צוגאַנג פֿאַר ראַק באַהאַנדלונג (Drost et al., 2017). אויסניצן די מאָלעקולאַרע פֿעיִקייטן פֿון טומאָרן, אַזאַ ווי גענעטישע, עפּיגענעטישע און טראַנסקריפּציאָנעלע חסרונות, פֿאַר מעדיצין אַנטוויקלונג קען פֿאַרבעסערן קלינישע רעזולטאַטן און רעדוצירן סקרינינג קאָסטן. CRISPR איז אַ פּאָטענציעל גען עדיטינג געצייַג וואָס קען ניט בלויז דעטעקטירן און ידענטיפֿיצירן ראַק-פֿאַראורזאַכנדיקע גענאָמישע צילן, נאָר קען אויך ווערן גענוצט צו רעדאַקטירן, אונטערדריקן און עפּיגענעטיש מאָדיפֿיצירן אָנקאָגענעס אין מענטשלעכע צעלן (טאַבעלע 1) (Ahmed et al., 2021). עטלעכע CRISPR סקרינז זענען דורכגעפֿירט געוואָרן צו זוכן גענעס פֿאַרבונדן מיט טומאָר סאַפּרעסערז, אָנקאָגענעס און מעדיצין קעגנשטעל. די נוצן פון CRISPR/Cas9 צו רעדאַקטירן פֿאַרשידענע TNBC אָנקאָגענעס ווערט געוויזן אין פֿיגור 2.
פיגור 2. גענע רעדאַקטירונג פון פֿאַרשידענע TNBC אָנקאָגענעס ניצנדיק CRISPR/Cas9, וואָס רעזולטירט אין פֿאַרקלענערט טומאָר וווּקס און מעטאַסטאַסיס. די אָנקאָגענעס אַרייַננעמען CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 און CXCR7, Crypto1, ROR1 און ST8SIA, וועלכע זענען ינוואַלווד אין דעם אויפֿטרעטן און מעטאַסטאַסיס פון TNBC.
קענסער צעל מיגראציע, אינוואַזיע, און עפּיטעליאַל-מעסענטשימאַל טראַנזישאַן (EMT) זענען פֿאַרבונדן מיט ITGA9. פֿריִערדיקע שטודיעס האָבן געוויזן אַז ITGA9 איז אַ שליסל שפּילער אין די נאָטש פּאַטוויי און שפּילט אַן אינטערעסאַנטע ראָלע אין ראַבדאָמיאָסאַרקאָמאַ מעטאַסטאַסיס (מאָליסט עט על., 2020). אין דערצו, ITGA9 איז געפֿונען צו זיין ענג פֿאַרבונדן מיט פּאַציענט פּראָגנאָז אין עטלעכע טומאָר טייפּס, אַרייַנגערעכנט ברוסט קענסער (וואַנג ז. עט על., 2019). אין דערצו, ביאָינפאָרמאַטיק אַנאַליסיס פון ITGA9 האָט געוויזן אַז זיין אויסדרוק אין TNBC איז געווען באַדייטנד העכער ווי אין אנדערע ברוסט קענסער סובטיפּעס. עלעוואַטעד ITGA9 לעוועלס זענען פֿאַרבונדן מיט טומאָר מעטאַסטאַסיס און רעלאַפּס אין TNBC פּאַטיענץ. נאַקאַוט פון ITGA9 דורך CRISPR/Cas9 ריזאַלטיד אין קענסער סטעם צעל (CSC)-ווי פּראָפּערטיעס, טומאָר אַנגיאָגענעסיס, טומאָר וווּקס, און רידוסט מעטאַסטאַסיס דורך פּראַמאָוטינג β-קאַטענין דעגראַדאַציע אין TNBC (וואַנג ז. עט על., 2019).
קריפּטאָ-1 איז אַ מיטגליד פון דער TGF-β משפּחה און איז קריטיש פֿאַר פרי עמבריאָגענעזיס, סטעם צעל וישאַלט, און ראַק מעטאַסטאַסיס (Ishii et al., 2021). אויך באַקאַנט ווי Tdgf-1, איז עס אַן אָנקאָגעניק GPI-אַנגקערד סיגנאַלינג פּראָטעין ינוואַלווד אין די רעגולאַציע פון ​​​​די פאָרמירונג פון די פּרימיטיוו סטריק, מעזאָדערם און ענדאָדערם, ווי געזונט ווי די פאַרלייגן פון לינקס / רעכט אַסימעטרי אין די אַנטוויקלונג פון גוף אָרגאַנען בעשאַס עמבריאָגענעזיס (Zhang et al., 2021b). דערצו, קריפּטאָ-1 איז געוויזן צו זיין ינוואַלווד אין עפּיטעליאַל-מעסענטשימאַל טראַנזישאַן (EMT) ווי אַ סטעם צעל מאַרקער (Zhang et al., 2021b). EMT איז קריטיש ניט בלויז פֿאַר פאַרשידן פּראַסעסאַז אַזאַ ווי עמבריאָניק אַנטוויקלונג, פיבראָסיס און ווונד היילונג, אָבער אויך פֿאַר ראַק ינוואַזיע און מעטאַסטאַסיס. דערצו, קריפּטאָ-1 איז געוויזן צו ינטעראַקט מיט פיר נאָטש רעצעפּטאָרן און פֿאַרבעסערן זייער פּאָסט-טראַנסלאַציאָנאַל מאַטוראַטיאָן (Brandstadter און Maillard, 2019). דער נאָטש סיגנאַלינג פּאַטוויי איז באַקאַנט צו זיין ינוואַלווד אין די וישאַלט פון מענטשלעכע ברוסט ראַק סעלז. שטודיעס האָבן געוויזן אַז CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד נאַקאַוט פון קריפּטאָ-1 סאַפּרעסיז ראַק וווּקס און מעטאַסטאַסיס. דעריבער, קריפּטאָ-1 קען ווערן אַ וויכטיק טעראַפּיוטיק ציל פֿאַר TNBC (קאַסטראָ עט אַל., 2015).
XCL12 פּראָטעין און זיין כעמאָקין רעצעפּטאָר CXC (CXCR4 און CXCR7) שפּילן פֿאַרשידענע ראָלעס אין ראַק צעל פּראָליפעראַציע, וווּקס, מיגראַציע און ינוואַזיע (Wu et al., 2015). די כעמאָרעסעפּטאָרס זענען געווען פֿאַרבונדן מיט דער אַנטוויקלונג פון TNBC דורך קייפל סיגנאַלינג פּאַטווייז אין ביידע אין וויוואָ און אין וויטראָ מאָדעלס (Wu et al., 2015). אין דערצו, אַקטיוואַציע פון ​​CXCR4 און CXCR7 איז פֿאַרבונדן מיט גרעסערע סאַסעפּטאַבילאַטי צו מעטאַסטאַסיס און שלעכט פּראָגנאָז אין TNBC (Karn et al., 2022). דעריבער, נאַקאַוט פון CXCR4 און CXCR7 קען ווערן עפעקטיוו מעדיצין ציל גענעס פֿאַר דער באַהאַנדלונג פון ברוסט ראַק, אַרייַנגערעכנט TNBC. שטודיע דורך Yang et al. Yang et al. (2019) געניצט CRISPR/Cas9 צו קאָ-נאַקאַוט די CXCR4 און CXCR7 גענעס און געפֿונען אַז TNBC פּראָליפעראַציע, וווּקס, מיגראַציע און ינוואַזיע זענען באַדייטנד ינכיבאַטיד (Yang et al., 2019).
פארגרעסערטע לעוועלס פון miR-3662, א TNBC אנקאגען, זענען באמערקט געווארן אין ברוסט קענסער געוועבן (Yi et al., 2022). א נאקדאון פון miR-3662 איז געוויזן געווארן צו אינהיביטירן ברוסט קענסער טומאר וואוקס און מעטאסטאזיס סיי אין וויווא און סיי אין וויטרא (אגארוואל און גופטא, 2021). HBP-1 איז א שטארקער אינהיביטאר פון Wnt/-קאטענין סיגנאלינג און איז מסתמא פאראנטווארטליך פאר miR-3662-מעדיאַטעד וואוקס פון TNBC צעלן. לעצטנס, Yi et al. האבן געפונען אז די miR-3662-HBP1 אקס רעגולירט די Wnt/-קאטענין סיגנאלינג וועג אין TNBC צעלן (Yi et al., 2022). צוליב זיין טומאר-ספעציפישן אויסדרוק, קען miR-3662 זיין א פאטענציעלער טעראפויטישער ציל פאר TNBC. אזוי, קען CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד נאקדאון פון miR-3662 זיין אן אויסגעצייכנטער צוגאנג פארן אנטוויקלען נייע מעדיקאמענטן פאר דער באהאנדלונג פון TNBC.
UBR5 איז אַ 300 kDa נוקלעאָפאָספאָפּראָטעין וואָס איז געוואָרן אידענטיפיצירט ווי אַ שליסל רעגולאַטאָר פון טומאָריגענעסיס, מעטאַסטאַסיס, און ימיון ענטפער אין פֿאַרשידענע קענסערס (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 איז געמאָלדן געוואָרן צו זיין העכסט אַפּרידזשיאַלד אין TNBC סאַמפּאַלז און סטימולירט ERα פונקציע דורך ינדוסינג פּראָליפעריישאַן דורך זיין יוביקוויטין ליגאַסע טעטיקייט (Bolt et al., 2015). גאַנצע עקסאָם סיקוואַנסינג שטודיעס פון ערשטיק TNBC סאַמפּאַלז האָבן אויך געוויזן געוואקסענע אויסדרוק פון UBR5, וואָס סאַגדזשעסט זיין ראָלע אין דער אַנטוויקלונג פון TNBC. דערצו, CRISPR/Cas9-געטריבן דילישאַן פון UBR5 האָט געוויזן באַדייטנדיק ינכיבישאַן פון TNBC מעטאַסטאַסיס און וווּקס אין עקספּערימענטאַלע מויז מאָדעלס. דערצו, ינקלוזשאַן פון UBR5 אין אַ ווילד-טיפּ מויז מאָדעל האָט צוריקגעשטעלט זיין פול פאַנגקשאַנאַליטי, כוועראַז דעם ווירקונג איז נישט באמערקט אין ינאַקטיווייטיד מוטאַנט סטריינז (Liao et al., 2017). מאַנגל פון UBR5 איז פֿאַרבונדן מיט געוואקסענע אַפּאָפּטאָסיס, נעקראָזיס, און אינהיביציע פון ​​טומאָר וווּקס אין TNBC רעכט צו שלעכטער אַנדזשיאָגענעסיס. רעכט צו דעם פֿאַרלוסט פון UBR5, טומאָר פֿאַרשפּרייטונג צו ווייטע אָרגאַנען איז רידוסט, און UBR5 ינדוסירט אַבנאָרמאַל EMT הויפּטזעכלעך דורך רעדוצירן E-cadherin אויסדרוק (Zhang און Weinberg, 2018). לעצטנס, UBR5 איז געוויזן צו זיין אַ זייער וויכטיקער פאַקטאָר אין IFN-γ-ינדוסט PDL1 טראַנסקריפּציע אין TNBC רעכט צו זיין מאַנגל פון E3 יוביקוויטינאַציע טעטיקייט. RNA טראַנסקריפּטאָם אַנאַליסיס האט גילוי אַז UBR5 קען האָבן סיסטעמישע יפעקס אויף גענעס פֿאַרבונדן מיט די IFN-γ פּאַטוויי און העכערן PDL1 טראַנסאַקטיוואַציע דורך פאַרגרעסערן אַקטיוואַציע לעוועלס פון פּראָטעין קינאַזע RNA (PKR) און זיין סיגנאַל טראַנסדוסערס און אַקטיוואַטאָרס. טראַנסקריפּציע 1 (STAT1) און ינטערפעראָן רעגולאַטאָרי פאַקטאָר 1 (IRF1). אבער, CRISPR/Cas9-פארמיטלד קאמבינירטע אבלאציע פון ​​UBR5 און PD-L1 אויסדרוק האט א סינערגיסטישן טעראפויטישן עפעקט ווי יעדע בלאקאדע אליין, מיט טיפע עפעקטן אויף דער טומאר מיקרא-אומגעבונג (Wu et al., 2022). אזוי, CRISPR/Cas9 קען זיין א וויכטיגער געצייג צו פארמיידן UBR5 פונקציע, דערמיט אונטערדריקן TNBC מעטאסטאז און טומאר וואוקס.
ROR1 איז אַ טיפ I טראַנסמעמבראַנע פּראָטעין וואָס ווערט אויסגעדריקט בעת ראַק און עמבריאָניק אַנטוויקלונג און איז געוואָרן אידענטיפיצירט ווי אַן אָנקאָפעטאַל פּראָטעין (ניקאָלאַס באָרטשערדינג, 2014). די ינווייסיוו נאַטור פון פאַרשידענע מענטשלעכע קענסערס איז פארבונדן מיט אַפּרעגולאַטיאָן פון ROR1. פּראַמישינג רעזולטאַטן זענען באקומען פון אין וויוואָ און אין וויטראָ שטודיעס וואָס אַרייַננעמען טעראַפּיוטיק קאַמפּאַונדז וואָס צילן ROR1 (Chien et al., 2016). עלעוואַטעד לעוועלס פון ROR1 mRNA אין ברוסט געוועב ביאָפּסיעס זענען אויך געווען פארבונדן מיט אַגרעסיוו באַסאַל-ווי ברוסט (BL) טומאָרס און זייער מיגראַטיאָן צו אנדערע טיילן פון דעם גוף. דערצו, אָוווערעקספּרעססיאָן פון ROR1 איז געוואָרן אידענטיפיצירט ווי אַ פּראָגנאָסטישע מאַרקער פֿאַר דער אַנטוויקלונג פון TNBC (Chien et al., 2016). אָבער, שטיל מאַכן ROR1 ניצן CRISPR/Cas9 צו סאַפּרעסן TNBC וווּקס און מעטאַסטאַסיס וואָלט זיין אַן עפעקטיוו סטראַטעגיע.
דער סיאַלילאַציע פּראָצעס באַשטייט פון צולייגן סיאַליק זויער צו גליקאָקאָנדזשוגאַטעס, וואָס ווערט קאַטאַליזירט דורך סיאַלילטראַנספעראַזעס (STs). ST8SIA1 געהערט צו דער ST משפּחה און שפּילט אַ וויכטיקע ראָלע אין דער פּאַטאָגענעסיס פון פֿאַרשידענע קראַנקייטן ווי לימפאָציטיש לויקימיאַ און קאָלאָרעקטאַל ראַק (טשאַנג עט על., 2018). RNA סיקוואַנס אַנאַליז ווייזט אַז ST8SIA1 איז העכסט אויסגעדריקט אין ברוסט געוועב פון TNBC פּאַטיענץ און איז פּאָזיטיוו קאָרעלירט מיט מוטאַציעס אין די טומאָר סאַפּרעססאָר דזשין p53, וואָס קען ביישטייערן צו דער פּאַטאָגענעסיס פון TNBC (באַטולאַ עט על., 2017). אין דערצו, ST8SIA1 איז ינוואַלווד אין די מעטאַסטאַסיס און ריקעראַנס פון TNBC, וואָס סאַגדזשעסט אַז עס שפּילט אַ וויכטיקע ראָלע אין די פּאַסירונג און אַנטוויקלונג פון TNBC. אין אַן אין וויטראָ מאָדעל פון TNBC, נאַקדאַון פון ST8SIA1 דורך CRIPSR/Cas9 איז געוויזן צו בלאָקירן וווּקס און מעטאַסטאַסיס (באַטולאַ עט על., 2017). דאָס סאַגדזשעסטירט אַז CRISPR/Cas9 קען זיין אַ וויכטיק געצייַג פֿאַר ינכיבאַטינג די פונקציע פון ​​​​די ST8SIA1 אָנקאָגענע אין דער באַהאַנדלונג פון TNBC.
NAT1 איז אַ מעטאַבאַלישער ענזיים וואָס קאַטאַליזירט די פאָרמירונג פון פאַזע II קסענאָביאָטישע קאַמפּאַונדז און ווערט אויסגעדריקט אין כּמעט אַלע מענטשלעכע געוועבן. NAT1 קען נוצן דעם קאָפאַקטאָר פאָלאַטע צו צילן אַסעטיל-CoA (אַסעטיל-CoA) אפילו אין דער אַוועק פון דעם אַראָמאַטישן אַמין סאַבסטראַט (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). שטודיעס האָבן געוויזן אַז NAT1 רעגולירט מאַטריץ מעטאַלאָפּראָטעינאַזע 9 (MMP9) פונקציע אין ברוסט ראַק צעל מאָדעלן און באַשיצט קעגן רעאַקטיווע זויערשטאָף מינים (ROS) בעשאַס גלוקאָזע הונגער (Wang et al., 2018). דילעשאַן פון NAT1 איז געוויזן צו ינכיבאַט די פּירווואַט דעהידראָגענאַזע קאָמפּלעקס, וואָס פירט צו מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע (Wang L. et al., 2019). דערצו, פאַרשידענע אנדערע באַריכטן האָבן געוויזן אַז NAT1 ינכיבישאַן ניצן קליינע מאַלעקולן און siRNA שטילקייט קען רעדוצירן די ינווייסיוונאַס און פּראָוליפעריישאַן פון ברוסט ראַק סעלז (Stepp et al., 2018). לעצטנס, איז CRISPR/Cas9 גענוצט געוואָרן צו אונטערדריקן NAT1 אין דער ברוסט ראַק צעל ליניע MDA-MB-231, וואָס האָט אַפעקטירט צעלולאַרע מעטאַבאָליזם לויט איר אויסדרוק לעוועל. די שטודיע האָט אויך געוויזן אַז NAT-1 איז קריטיש פֿאַר דער פּראָגרעסיע און מעטאַסטאַזיס פון TNBC (Carlisle et al., 2020).
קאָאָרדינירטע טראַנסקריפּציע פון ​​אָנקאָגענעס ווערט רעגולירט דורך סופּער ענהאַנסערס, טראַנסקריפּציע פאַקטאָרן און קאָפאַקטאָרן (Hnisz et al., 2015). דערצו, אַ גרופּע פון ​​סייקלין-אָפּהענגיקע קינאַזעס (CDKs), אַזאַ ווי CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, און CDK13, זענען נויטיק פֿאַר טראַנסקריפּציאָנעלע רעגולאַציע. צווישן זיי, CDK7 איז ינוואַלווד אין דער פאָספאָרילאַציע פון ​​RNA פּאָלימעראַזע II, וואָס איז זייער וויכטיק פֿאַר דער איניציאַציע און יקספּאַנשאַן פון אָנקאָגענע טראַנסקריפּציע אין דער פּאַטאָגענעסיס פון TNBC. אין אַ וויכטיקער שטודיע, דילישאַן פון CDK7 דורך CRISPR/Cas9 האָט ינכיבאַטיד TNBC, וואָס ינדיקייץ אַז די פּאַטאָגענעסיס פון TNBC איז CDK7 אָפּהענגיק (Wang Y. et al., 2015).
שטודיעס האבן געוויזן אז מוטאציעס אין MYC און RBP (RNA בינדינג פראטעין) קענען פירן צו אפאפטאזיס, בשעת איין-גענע מוטאציעס אין MYC אדער RBP ווירקן נישט אויף דעם וואוקס פון קענסער צעלן (איינשטיין עט אל., 2021). מער ווי 1000 RBPs אין דעם מענטשלעכן גענאם זענען געווארן געסקרינט מיט א CRISPR/Cas9-באזירטע ביבליאטעק. צווישן זיי, 57 RBPs זענען געפונען געווארן קריטיש פארן וואוקס פון קענסער צעלן מיט שטארק פארהויכטע MYC לעוועלס (Wheeler et al., 2020). דערצו, YTHDF2 איז וויכטיג פארן אויפהאלטן TNBC צעל וואוקס און פארקלענערט די צאל מעטילירטע טראנסקריפּטן בעת ​​הויך-לעוועל טראנסקריפציע און טראנסלאציע אין קענסער צעלן מיט העכערע MYC אויסדרוק. דערצו, YTHDF2 איז נישט עסענציעל פאר קענסער צעלן, וועלכע זענען ווייניגער אפהענגיק אויף פארהויכטע MYC לעוועלס צו פארלענגערן די איבערלעבונג פון TNBC פאציענטן (איינשטיין עט אל., 2021), וואס סאגדזשעסט אז עס קען זיין א פאטענציעלע טעראפויטישע ציל פאר מעדיקאמענטן וואס קענען באקעמפן TNBC.
צינק פינגער פּראָטעאינען (ZNFs) מאַכן אויס אַרום 1% פֿון דעם גאַנצן מענטשלעכן גענאָם. שטודיעס האָבן געוויזן אַז ZNF קען רעגולירן צעל פּראָליפֿעראַציע אין פֿאַרשידענע קענסערס, ווי לעבער קענסער, ברוסט קענסער און קאָלאָרעקטאַל קענסער (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). ביבליאָטעקן גענערירט דורך CRISPR נאַקאַוט זענען געניצט געוואָרן צו סקרינען פֿאַרשידענע טומאָר סאַפּרעסער גענעס (TSGs) אין ברוסט קענסער צעלן (Shalem et al., 2014). זינט דעמאָלט, אַ טראַנסקריפּטאָמישע שטודיע פֿון CRISPR/Cas9 ZNF319-געמעקטע ברוסט קענסער צעלן האָט געוויזן אַז ZNF319 איז אַ טומאָר סאַפּרעסער גענע וואָס רעדוצירט ברוסט קענסער פּראָליפֿעראַציע און איז דעריבער פֿאַרבונדן אין פֿאַרשידענע פּאָטענציעלע סיגנאַלינג מעקאַניזמען און אַנדערע ביאָלאָגישע פֿונקציעס (Wang L. et al., 2022).
פעראָפּטאָסיס איז אַ טיפּ פּראָגראַמירטער צעל טויט וואָס איז אָפענגיק אויף דער אנוועזנהייט פון אייַזן. עס איז באַקאַנט אַז די אַנטוויקלונג פון פעראָפּטאָסיס איז באַאיינפלוסט דורך דער אנוועזנהייט פון ליפּיד פּעראָקסידן. אין דערצו, PKCβII איז געמאלדן צו ווייַזן פרי ליפּיד פּעראָקסידאַטיאָן, און געוואקסן ליפּיד פּעראָקסידאַטיאָן איז פארבונדן מיט פעראָפּטאָסיס. סקרינינג אַ ביבליאָטעק פון CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד קינאַסע ינכיבאַטאָרס האט גילוי אַז PKCβII איז ינוואַלווד אין דעם פּראָצעס פון ליפּיד פּעראָקסידאַטיאָן, וואָס איז קריטיש פֿאַר פעראָפּטאָסיס אין MDA-MB-231 סעלז (Zhang et al., 2022). דעריבער, דאָס סאַגדזשעסץ אַז נאַקאַוט פון PKCβII דורך CRISPR/Cas9 קען זיין אַ פּאָטענציעל טומאָר סאַפּרעססאָר דזשין ציל פֿאַר די באַהאַנדלונג פון פעראָפּטאָסיס-פֿאַרבונדענע חולאתן (Zhang et al., 2022).
מעדיקאַמענט קעגנשטעל ווערט געהאלטן צו זיין פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר בעערעך 90% פון טויטפעלער אין ראַק פּאַטיענץ און איז איינער פון די הויפּט טשאַלאַנדזשיז אין ראַק באַהאַנדלונג (Bukowski et al., 2020). די רעזולטאַטן ווייַזן אַז אַ גענוגיק נומער פון גענעס שייך צו מעדיקאַמענט אויספלוס, DNA פאַרריכטן, אַפּאָפּטאָסיס און פאַרשידן צעל סיגנאַלינג פּאַטווייז זענען פארבונדן מיט מעדיקאַמענט קעגנשטעל (Haider et al., 2020). צווישן זיי, עטלעכע גענעס זענען געווען טאַרגעטעד דורך CRISPR/Cas9 מכשירים און האָבן געוויזן פּראַמאַסינג רעזולטאַטן אין רידוסינג מעדיקאַמענט קעגנשטעל און ינקריסינג די עפעקטיווקייַט פון אַנטי-ראַק טריטמאַנץ (Vaghari-Tabari et al., 2022). אין אַדישאַן, הויך-דורכדרינגלעך CRISPR/Cas9 דזשין נאַקאַוט סקרינינג לייברעריז זענען ימפּליקייטיד אין מאָדיפיצירן די פונקציע פון ​​פּאָטענציעל מעדיקאַמענט קעגנשטעל דזשין טאַרגאַץ (Shalem et al., 2015). כדי צו אידענטיפיצירן פּאַקליטאַקסעל קעגנשטעל גענעס, RNA סיקוואַנסינג צוזאַמען מיט גענאָם-ברייט sgRNA ביבליאָטעק סקרינינג איז געניצט געוואָרן צו אידענטיפיצירן אַכט קאַנדידאַט גענעס, אַרייַנגערעכנט היסטאָן דעאַסעטילאַזע 9 (HDAC9), וואָס זענען פֿאַרבונדן מיט מעדיצין קעגנשטעל אין פּאַטיענץ מיט ריקעראַנט TNBC (B et al., 2020). אין אַן אַנדערער שטודיע, איז באמערקט געוואָרן אַ געוואקסענע אויסדרוק פון דיסערין/טהרעאָנין און טיראָסין פּראָטעין קינאַזע (DSTYK) בעת די ניצל פון TNBC פּאַטיענץ באהאנדלט מיט אַנטיקאַנסער דרוגס. דערצו, CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד נאַקדאַון פון DSTYK האט באַדייטנד פֿאַרשטאַרקט אַפּאָפּטאָסיס פון מעדיצין-קעגנשטעליק ראַק סעלז אין וויטראָ (SUM102PT סעלז און MDA-MB-468 סעלז) און אַן אין וויוואָ TNBC מאָדעל (Ogbu et al., 2021).
כאָטש TNBC האט אַנאָרמאַלע אַקטיוואַציע פון ​​די MAPK פּאַטוויי, איז דער קלינישער עפֿעקט פֿון MEK-געצילטע טעראַפּיעס שוואַך. אַ CRISPR/Cas9 גענאָמישע ביבליאָטעק סקרין האָט אַנטפּלעקט אַז אינהיביציע פֿון PSMG2 (פּראָטעאָם אַסעמבלי שאַפּעראָן 2) סענסיטיזירט TNBC BT549 און MB468 צעלן צו דעם MEK אינהיביטאָר AZD6244. CRISPR/Cas9 נאָקדאַון פֿון PSMG2 האָט געביטן נאָרמאַלע פּראָטעאַסאָם פֿונקציע, וואָס פֿירט צו אַוטאָפֿאַגי-מעדיאַטעד דיסאַסעמבלי פֿון PDPK1, דערמיט ווייטער פֿאַרבעסערנדיק טומאָר צעלן אין TNBC מויז מאָדעלן ינדוסט דורך AZD6244 (MEK אינהיביטאָר) און MG132 (פּראָטעאַסאָם אינהיביטאָר). אַזוי, פּראָטעאַסאָם און MAP קינאַסע (MEK) אינהיביטאָרן קענען זיין אַדמיניסטרירט סינערגיסטיש צו רעדוצירן טומאָר צעל פּראָליפֿעראַציע (וואַנג X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 איז אויך גענוצט געוואָרן צו סקרינען פֿאַר פֿאַרלוסט פֿון גענע פֿונקציע וואָס פֿירט צו TNBC קעגנשטעל (Shu et al., 2020). Ge et al. האָבן דערקלערט דעם מעכאַניזם פֿון מעדיצין קעגנשטעל פֿון ראַק צעלן באַהאַנדלט מיט JQ1, אַ BET בראָמאָדאָמאַין אינהיביטאָר (BBDI), אין TNBC. ניצנדיק CRISPR/Cas9, האָבן זיי געפֿונען אַז די אויסמעקן פֿון דעם rb1 גענע האָט געפֿירט צו דעם TNBC צו ווערן קעגנשטעליק צו דער אַנטי-ראַק מעדיצין JQ1. דעריבער, איז rb1 פֿונקציע וויכטיק אין דער רעאַקציע צו JQ1 מעדיצינען אין TNBC. זיי האָבן אויך געמאָלדן אַז פּאַקליטאַקסעל איז אַ CDK4/6 קינאַזע/מיקראָטובול אינהיביטאָר, און זײַן קאָמבינאַציע מיט BBDIs ווי JQ1 קען צושטעלן פֿאַרשפּרעכנדיק טעראַפּעווטישע רעאַקציעס צו מעדיצין-רעזיסטענט TNBC (Ge et al., 2020).
די טראַנסקריפּציאָנעלע לאַנדשאַפט פון לאַנג ניט-קאָדירנדיק RNA (lncRNA) איז געמאלדן געוואָרן צו זיין פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר קעגנשטעל צו נעאָאַדזשווואַנט טעראַפּיע אין TNBC. די שטודיע ווייזט אַז פינף פאַרשידענע MALAT1 lncRNA טראַנסקריפּטן זענען העכסט אויסגעדריקט אין TNBC. דערצו, CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד דילישאַן פון MALAT1 האט געוואקסן די סענסיטיוויטי פון TNBC BT-549 סעלז צו פּאַקליטאַקסעל און דאָקסאָרוביסין, וואָס סאַגדזשעסט אַ פּאָטענציעלע ראָלע פֿאַר MALAT1 קעגנשטעל אין TNBC (Shaath et al., 2021).
מוטאַציעס אין BRCA1 (BRCA1m) זענען העטעראָגענע און דעריבער שווער צו דעטעקטירן. צילן אויף PARP1 (פּאָלי(ADP-ריבאָז) פּאָלימעראַזע), דער סינטעטישער טויטלעכער פּאַרטנער פון BRCA1, קען פאַרגרעסערן TNBC מעדיקאַמענט כעמאָסענסיטיוויטי. ניצן CRISPR/Cas9, דילישאַן פון PARP1 האט געוואקסן די סענסיטיוויטי פון אַנטיקאַנסער מעדיקאַמענטן ווי דאָקסאָרוביסין, געמסיטאַבין און דאָסעטאַקסעל צו mBRCA1 מוטאַנט TNBC צעלן, וואָס סאַגדזשעסט אַז PARP1 איז אויך ינוואַלווד אין מעדיקאַמענט קעגנשטעל אין TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). מוטאַציעס אין די טומאָר סאַפּרעסער גענעס BRCA1 אָדער BRCA2 זענען באַקאַנט צו פאַרגרעסערן די ליקעליהאָאָד פון אַנטוויקלען ברוסט ראַק אין מענטשן. באַהאַנדלונג פון די פּאַטיענץ ריקווייערז די נוצן פון PARP ינכיבאַטאָרס. דערצו, איז עס געוויזן געוואָרן אַז נאַקאַוט פון דעם נוקלעאָטיד סאַלוואַדזש פאַקטאָר DNPH1 ניצנדיק CRISPR/Cas9 קען אַוועקנעמען דעם טאַקסישן נוקלעאָטיד 5-הידראָקסימעטהילדעאָקסיורידין (hmdU) מאָנאָפאָספאַט, דערמיט פֿאַרשטאַרקנדיק די רעאַקציע פון ​​BRCA-דעפֿיציענט צעלן צו סענסיטיוויטי צו PARP אינהיביטאָרן (Fugger). et al., 2021). אַזוי, CRISPR/Cas9 און PARP1 אינהיביטאָרן קענען ווערן אַ וויכטיקע באַהאַנדלונג סטראַטעגיע פֿאַר TNBC.
דאס פּענעטראַנט גליקאָפּראָטעין (P-gp) גען איז א מולטי-דראַג קעגנשטעל גען וואָס איז בכלל אַפּראָוגרייטעד אין בערך 41% פון אַלע TNBC (Sun et al., 2020). P-gp-ינדוסט דראַג עפלוקס איז געוואָרן אידענטיפיצירט ווי א שליסל רעגולאַטאָר פון דראַג קעגנשטעל אין ברוסט ראַק. P-gp אינהיביטאָרן האָבן דעמאָנסטרירט געוואקסן סענסיטיוויטי צו אַנטי-קאַנסער דרוגס אין ברוסט ראַק (Famta et al., 2021). אזוי, CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד אַבליישאַן אָדער סאַפּרעשאַן פון P-gp און P-gp אינהיביטאָרן קען זיין זייער וויכטיק מעטהאָדס צו באַקומען דראַג קעגנשטעל אין TNBC.
ATP-בינדינג קאַסעט טראַנספּאָרטער G2 (ABCG2) איז באַקאַנט צו פאַראורזאַכן מעדיצין קעגנשטעל אין TNBC (Palasuberniam et al., 2015), כאָטש עס זענען דערווייל נישטאָ קיין באַריכטן וועגן דער באַציִונג צווישן CRISPR/Cas9 און ABCG2 שטילמאַכן און טומאָר סאַפּרעסער דזשין ינאַקטיוואַציע. PTEN קען פאַרבעסערן ABCG2 אַקטיוואַציע (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). דעריבער, ניצן CRISP/Ca9 צו באַזייַטיקן ABCG2 און קאַמביינינג עס מיט אַן ABCG2 ינכיבאַטאָר קען זיין אַ פּאַסיק באַהאַנדלונג צו באַקומען מעדיצין קעגנשטעל אין TNBC. טיש 2 דערמאָנט CRISPR/Cas9 טאַרגעטינג אַלע קעגנשטעל גענעס.
טאַבעלע 2. CRISPR/Cas9 צילט פֿאַרשידענע TNBC קעגנשטעל גענעס צו סענסיטיזירן צעלן צו אַנטי-קאַנסער דרוגס.
CRISPR/Cas9 ביבליאָטעקן זענען פּאָטענציעלע מכשירים פֿאַר סקרינינג גענע מוטאַציעס פֿאַרבונדן מיט ראַק פּאַטאָגענעסיס (Chan et al., 2022). די סקרינינג מעטאָדע ינוואַלווז פיר טריט אַזאַ ווי (אַ) ביבליאָטעק קאַנסטראַקשאַן, (ב) לענטיוויראַל טראַנסדאַקשאַן, (ג) פענאָטיפּיק סקרינינג, און (ד) ציל גענע אַנאַליסיס. כאָטש TNBC האט אַבנאָרמאַל אַקטיווירונג פון די MAPK פּאַטוויי, די קליניש פּראָגנאָז פון MEK טאַרגעטעד טעראַפּיע פֿאַר TNBC פּאַטיענץ וואָס טראָגן מוטאַציעס אין טומאָר סאַפּרעססאָר גענעס אַזאַ ווי PTEN, RB1, און TP53 איז זייער שלעכט.
דערצו, א גענע נאַקאַוט סקרין ניצנדיק CRISPR/Cas9 האט געטעסט די מערסט שטאַרקע און סעלעקטיווע מאָלעקול, דעהידראָקאַטראָל, וואָס איז שעפעדיק אין גוואַטעמאַלאַן בלומען און בלעטער עקסטראַקטן, צו פֿאַרשטיין די ווירקונג פון דעהידראָקאַטראָל אויף MDA-MB-231. מעханіזמען פון סעלעקטיווע צעל ציטאָטאָקסיסיטי. מעזענטשימאַל סטעםנעס קעראַקטעריסטיקס פון TNBC סובטיפּעס. דעם CRISPR/Cas9-באַזירט סקרין האט אויך גילוי אַז HSD17B11, אַ גענע וואָס קאָדירט 17β-הידראָקסיסטערויד דעהידראָגענאַזע טיפּ 11, איז העכסט אויסגעדריקט אין MDA-MB-231 סעלז און רעזולטאַטן אין דעהידראָפאַלקאַרינאָל ספּעציפיש פֿאַר MDA-MB-231 סעלז (Grant et. al., 2020). אזוי, דאָס סאַגדזשעסץ אַז CRISPR/Cas9 גענאָמיק סקרינינג האט גרויס פּאָטענציעל אין ידענטיפיצירן די מעханіזמען אַנדערלייינג די אַנטיקאַנסער פּראָפּערטיעס פון פּאָטענציעל נאַטירלעך קאַמפּאַונדז.
דערצו, די וואַלנעראַביליטי פון TNBC צו ראַק איז געווען שטודירט מיט אַן אומפּאַרטיייש גענאָם-ברייט אין וויוואָ CRISPR/Cas9 סקרין, וואָס האָט געוויזן אַ פֿאַרבינדונג צווישן אָנקאָגעניק און טומאָר סאַפּרעסער פּאַטווייז. שליסל קאָמפּאָנענטן פון די mTOR און Hippo פּאַטווייז זענען געמאלדן צו שפּילן וויכטיקע ראָלעס אין טומאָר רעגולאַציע אין TNBC. דערצו, שטודיעס האָבן געוויזן אַז פאַרמאַקאַלאַדזשיקאַל ינכיבישאַן פון mTORC1/2 און YAP אָנקאָפּראָטעין יפעקטיוולי ינכיבאַץ די פּאַטאַדזשענסיטי פון TNBC מיט אַן אין וויטראָ מעדיצין-מאַטריץ סינערדזשי מאָדעל און אין וויוואָ פּאַציענט-דערייווד קסענאָגראַפטס. דערצו, טאָרין-1-מעדיאַטעד mTORC1/2 ינכיבישאַן ענכאַנסיז מאַקראָפּינאָסיטאָסיס, כוועראַז ווערטעפּאָרפין-ינדוסט YAP ינכיבישאַן פירט צו TNBC צעל טויט. צוזאַמען גענומען, די רעזולטאַטן הויכפּונקט די מאַכט און ראָובאַסטנאַס פון גענאָם-ברייט אין וויוואָ CRISPR סקרינינג צו ידענטיפיצירן נייַע און עפעקטיוו טריטמאַנץ פֿאַר TNBC (דאַי עט על., 2021).
דיסרעגולאציע פון ​​דעם אימונעם סיסטעם איז א וויכטיגער פאקטאר אין טומאריגענעסיס. קענסער צעלן אנטלויפן אימונע קלירענס דורך בייפּאַסן פארטיידיקונג מעקאַניזמען, אַרייַנגערעכנט אריינמישונג אין דער טעטיקייט פון אימונע צעלן אין דער טומאָר מיקראָ-סביבה און קאָמפּראָמיטירן דעם אימונעם סיסטעם. דעריבער, אַנטוויקלען אַ פֿאַרבעסערטן אימונעם סיסטעם קען זיין אַ שליסל צוגאַנג צו קעמפן טומאָרן. די נוצן פון CRISPR/Cas9-באַזירט גען מאָדיפיקאַציע אַדרעסירט עטלעכע ישוז שייך צו אימונע דיספונקציע פון ​​​​פאַרשידענע פּערספּעקטיוון. CRISPR/Cas9 איז געניצט געוואָרן צו פֿאַרבעסערן אַנטי-טומאָר ימיונאַטי קעגן ברוסט קענסער דורך די פאלגענדע וועגן (פיגור 3).
פיגור 3. CRISPR/Cas9 אימונאָטהעראַפּיע צילט TNBC צעלן. פארלוסט פון CDK5 און נאַקדאַון פון PDL1 און CD155 פארשטארקן דעם אימונעם סיסטעם. אזוי אויך, פארלוסט פון A2AR און נאַקדאַון פון TAAs ווי HER2, מיוצין 1 און TEM8 האט פארגרעסערט די עפעקטיווקייט פון CAR-T צעלן אין טייטן ראַק צעלן. CRISPR/Cas9-געטריבן T צעל סקרינינג האט געוויזן אז דיסראַפּשאַן פון p38 קינאַסע פארשטארקט T צעל אַנטיטומאָר טעטיקייט. T צעלן מאָדיפיצירט דורך CRISPR/Cas9 פארגרעסערן די אויסדרוק פון TCR (T צעל רעצעפּטאָר), ריזאַלטינג אין T צעלן מיט אַנטיטומאָר טעטיקייט.
די ציל פון אימונאָטהעראַפּיע איז צו סטימולירן דאָס אימונע סיסטעם צו אַטאַקירן ראַק צעלן. איבער-עקספּרעסיע פון ​​אימונע טשעקפּוינט פּראָטעאינען פאַרהיט געוויינטלעך אויטאָימונע רעאַקציעס אָבער קען העלפֿן קענסערס זיי צו ויסמיידן (טאָפּאַליאַן עט על., 2015). די פּראָטעאינען פאַרהיטן אימונע רעאַקציעס דורך בינדן צו רעצעפּטאָרן אויף דער ייבערפלאַך פון אימונע צעלן. קייפל טשעקפּוינט פּראָטעאינען (אַזאַ ווי CD155 און PD-L1) צילן דעם PD-1 רעצעפּטאָר אויף אימונע צעלן און ווערן אויסגעדריקט אין ברוסט ראַק, ספּעציעל TNBC (לי י.-C. עט על., 2020). נאַקדאַון פון PD-L1 אָדער זיין רעצעפּטאָר ניצן CRISPR/Cas9 קען סטימולירן דאָס אימונע סיסטעם צו אַטאַקירן TNBC טומאָרן (יאַהאַטאַ עט על., 2019). דערצו, דאַונרעגולאַציע פון ​​PD-L1 אויסדרוק דורך CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד דילישאַן פון CDK5 איז געוויזן צו ינכיבאַט טומאָר וווּקס אין וויטראָ און אין וויוואָ (דענג עט על., 2020). וואוקס אינהיביציע אין אין וויטראָ און אין וויוואָ מאָדעלן פון ברוסט ראַק סאַגדזשעסט אַז shRNA-מעדיאַטעד רעדוקציע פון ​​CD155 קען האָבן אַ טעראַפּיוטיש ווירקונג אויף ברוסט ראַק (גאַאָ עט על., 2018).
CAR T צעלן אויסדריקן CARs וואָס דערקענען טומאָר-פֿאַרבונדענע אַנטיגענס (TAAs) און קענען נוצן נאַקדאַון פון טשעקפּוינט פּראָטעאינס צו פֿאַרבעסערן זייער טעטיקייט (Li C. et al., 2020). עס זענען פֿאַרשידענע פּאָטענציעלע צילן פֿאַר CAR T צעל טעראַפּיע אין ברוסט ראַק, אַרייַנגערעכנט עטלעכע TAAs אַזאַ ווי HER2, mucin1, און TEM8 (Bajgain et al., 2018). עס איז באַווייַזן אַז CAR T צעלן וואָס צילן מעסאָטהעלין (איבער-אויסגעדריקט אין TNBC BT-459 צעלן) זענען מער עפעקטיוו קעגן ראַק ווען PD-1 איז נאַקאַד אויס ניצן CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). אָבער, אפגעזונדערט T צעלן פון פּאַטיענץ און דאַן רעדאַקטירן זיי ex vivo איז אַ אַרבעט-אינטענסיוו און צייט-קאַנסומינג פּראָצעס. כאָטש וניווערסאַל T צעלן קענען רעדוצירן אפגעזונדערטקייט רעקווירעמענץ, דאָנאָר T צעלן וואָס אויסדריקן מענטשלעך לויקאָסיט אַנטיגען (HLA) קלאַס I און T צעל רעצעפּטאָר (TCR) זאָל זיין אַוועקגענומען צו פאַרמייַדן גראַפט-ווערסאַס-האָסט אַבנאָרמאַלאַטיז (Ren et al., 2017, 2017a). ניצנדיק CRISPR/Cas9, קען HDR גלייכצייטיג עלימינירן TCR און HLA און אויסשלאגן דעם גען וואס קאדירט CAR. שטודיעס האבן געוויזן אז CRISPR/Cas9 קען גענוצט ווערן צו אריינפירן אנטי-CD19 CARs אין דעם TCR לאקוס, דערמיט עפעקטיוו פראדוצירנדיק CARs אן אויסשעפּן T צעלן (Dimitri et al., 2022). מולטיפלעקס טעכנאלאגיעס זענען אנטוויקלט געווארן צו שאפן אלאגענעישע CAR T צעלן דורך גלייכצייטיג עלימינירן TCR, בעטא-2-מיקראגלאבולין (B2M), HLA-I סוביוניט און אנדערע פראטעאינען ווי PD-1 און CTLA-4, וועלכע קענען האבן גרעסערע אנטי-קענסער אייגנשאפטן קעגן TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
ניצן CRISPR/Cas9 קען פֿאַרבעסערן די עפֿעקטיווקייט פֿון CAR-T צעלן. אַדענאָסין איז באַקאַנט צו האָבן אימונאָסאַפּרעסיווע אייגנשאַפֿטן און קען רעדוצירן אַנטי-קאַנסער ימיונאַטי דורך בלאָקירן T צעל פֿונקציע און אַקטיווירן אַדענאָסין A2A רעצעפּטאָרן (A2AR) (Vigano et al., 2019). שטילמאַכן A2AR ניצן CRISPR/Cas9 האָט באַדייטנד פֿאַרבעסערט די עפֿעקטיווקייט פֿון CAR-T צעלן אין וויוואָ (Giuffrida et al., 2021). T צעלן זענען באַקאַנט צו ווײַזן פֿאַרשידענע פֿענאָטיפּישע קעראַקטעריסטיקס ווי צעלולאַרע יקספּאַנשאַן, דיפֿערענציאַציע, אָקסידאַטיוו דרוק און גענאָמישן דרוק. CRISPR/Cas9-באַזירטע T צעל סקרינינג האָט אַנטפּלעקט דיסראַפּשאַן פֿון 25 פֿאַרשידענע T צעל רעצעפּטאָר קינאַזעס. צווישן זיי, דילישאַן פֿון p38 קינאַזע איז געוויזן געוואָרן צו פֿאַרבעסערן די אַנטי-טומאָר טעטיקייט פֿון T צעלן, וואָס ווײַזט אָן אַז p38 קינאַזע איז אַ שליסל רעגולאַטאָר פֿון CAR-T צעל רעגולאַציע (Gurusamy et al., 2020).
טי צעלן קענען ווערן גענעטיש מאדיפיצירט מיט CRISPR/Cas9 צו פראדוצירן שטארק אויסגעדריקטע TCRs. טראנספערירן גענעטיש מאדיפיצירטע טי צעלן צו פאציענטן האט געוויזן שטארקערע אנטי-קענסער טעטיקייט ווי ענדאגענע טי צעלן. דעריבער, קענען ענדאגענע טי-צעלן קאנקורירן מיט גענעטיש געענדערטע TCRs אין פאציענטן, וואס קען אפעקטירן דעם פאטענציאל פון קענסער אימונאטעראפיע. כדי צו באקעמפן דעם פראבלעם, קען ניצן CRISPR/Cas9 צו באזייטיגן ענדאגענע טי-צעל-β אין באקומער צעלן און דערנאך טראנספערירן טי-צעלן-β צו קענסער פאציענטן אויסשטעלן בעסערע אנטי-קענסער אימונע רעאקציעס אן די נויטווענדיקייט פון ענדאגענע טי-צעל סעקסועלע קאנקורענץ (פאן עט אל. 2018). אזוי, מיט דער אויסנאם פון CRISPR-מאדיפיצירטע טי צעלן, זענען טי-צעלן טויזנט מאל מער סענסיטיוו צו טומאר אנטיגענס ווי נארמאלע טי-צעל-טראנסדוסירטע טי צעלן. דערצו, אין פארשידענע לויקעמיעס, ווייזן געענדערטע טי צעלן גענערירט דורך γδ טי-צעל+ קריספרס העכערע אויסדרוק פון CD4+ און CD8+ טי צעלן ווי סטאנדארט טי-צעל טראנספער (לעגוט עט אל., 2018). אזוי, מאדיפיצירטע טי צעלן גענערירט דורך CRISPR/Cas9 קענען זיין אן עפעקטיווע אימונאטעראַפּיע מעטאָדע צו באַזיגן TNBC.
אינטעגרינס זענען צעל אדכעזשאַן מאַלעקולן וואָס זענען פאָרשטעלן אין צעלולאַר טראַנסמעמבראַנעס און העכערן די ביינדינג פון סעלז צו די עקסטראַסעלולאַר מאַטריץ (ECM) (האַמידי און יוואַסקאַ, 2018). דיסרעגולאַטיאָן פון אינטעגרינס איז פארבונדן מיט ראַק אַנטוויקלונג און מיגראַציע דורך טשאַנגינג די עקסטראַסעלולאַר מאַטריץ, וואָס פירט צו ראַק צעל ניצל אין די סערקולאַציע (האַמידי און יוואַסקאַ, 2018). CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד אינטעגרין נאַקדאַון פאַרלאַנגזאַמט טומאָר פּראָגרעס, מעטאַסטאַסיס און קאָלאָניזאַציע אין TNBC. נאַקדאַון פון אינטעגרין a5 (ITGA5) איז געמאלדן צו רעדוצירן צעל מיגראַציע און פּראָגרעס אין אנדערע ראַקס אַזאַ ווי לונג ראַק (דזשו עט על., 2017), סאַגדזשעסטינג אַז אינטעגרין a5 קען אויך זיין אַ שליסל פאַקטאָר אין די פּאַטאָגענעסיס פון TNBC.
שאַפֿן נאַקאַוט מײַז מיט טראַדיציאָנעלע עמבריאָנישע סטעם (ES) צעל מעטאָדן איז אַן אַרבעטס-אינטענסיווער, צײַט-פֿאַרברויכנדיקער און נישט-עפֿעקטיווער פּראָצעס. עס נעמט חדשים און יאָרן צו צילן ES צעלן דורך האָמאָלאָגישע רעקאָמבינאַציע, צוציען כימערישע מײַז, און דערנאָך זיי איבערקרייַצן מיט העטעראָזיגאָוס מײַז צו פּראָדוצירן האָמאָזיגאָוס קינדער. קאָמפּלעקסע איבערקרייַצונג איז נויטיק צו שאַפֿן מײַז מיט קייפל גענעטישע מוטאַציעס. אָבער, פילע פּראָבלעמען זענען אויפֿגעקומען ווען מען ניצט מײַז וואָס זענען גענערירט געוואָרן דורך אַבלאַציע פֿון ES צעלן מיט CRISPR/Cas9 אָדער דורך מיקראָאינדזשעקטירן CRISPR/Cas9 קאָמפּאָנענטן אין איין-צעל באַפֿרוכטע אייער. למשל, די אײַנפֿיר פֿון ענדערונגען פּאַסירט אָפֿט בײַ ביאַלעלישע לאָסי ​​און איז נישט גען-ספּעציפֿיש. לעצטנס איז געמאָלדן געוואָרן אַז ES צעלן מיט CRISPR/Cas9 טעכנאָלאָגיע קענען גלײַכצײַטיק אַרײַנשטעלן ביאַלעלישע מוטאַציעס אין ביז 5 גענען (Nishizono et al., 2021). פֿאַר דעם צוועק, זענען Cas9 mRNA און פֿינף גען-ספּעציפֿישע gRNAs גלײַכצײַטיק טראַנספֿעקטירט געוואָרן אין ES צעלן. דאָס אונטערשטרייכט די צוזאָג און עפעקטיווקייט פון דעם פּראָצעדור, כאָטש די מוטאַציעס זענען מעגלעך איבערגעגעבן געוואָרן ווען גרינדער ליניעס זענען געצויגן געוואָרן צו פּראָדוצירן קווינטופּל נאַקאַוט מײַז. די שטודיע באַריכטעט אויך אַן איבעראשנדיקע ענטדעקונג: ES צעלן זענען מער נישט נויטיק צו שאַפֿן גענעטיש מאָדיפֿיצירטע מײַז. אַנשטאָט, צו באַזייַטיקן ספּעציפֿישע גען פּראָדוקטן, Cas9 mRNA און gRNA זענען ינדזשעקטעד געוואָרן אין איין-צעל בינע עמבריאָס. ווי אַ רעזולטאַט, נאַקאַוט גרינדער ליניעס זענען באשאפן געוואָרן וואָס קענען טעאָרעטיש געניצט ווערן צו שטודירן די קאַנסאַקווענצן פון גען דילישאַן אין מײַז (Qin et al., 2016). אַזוי, CRISPR/Cas9 אַלאַוז די שאַפונג פון טראַנסגעניק מײַז צו מייַכל TNBC מיט אַ נידעריקער קאָסטן ווי טראַדיציאָנעל גענעטיש אינזשעניריע. ניצנדיק די CRISPR/Cas סיסטעם, אַ נייַ נאַקאַוט מויז מאָדעל איז דעוועלאָפּעד געוואָרן וואָס קען הצלחה ינטראָודוסינג פונט מוטאַציעס אין איין אָדער מער ענדאָגענאָוס גענעס אין TNBC. באַזירט אויף דעם קאָנצעפּט, קענען כייַע מאָדעלן פון TNBC אויך ווערן דעוועלאָפּעד ניצן CRISPR/Cas9-מעדיאַטעד דילישאַן פון BRCA1 און p53, ריזאַלטינג אין אָנווער פון HR ריפּער, גענאָמיש ינסטאַביליטי, און מוטאַנט פענאָטיפּעס (Annunziato et al., 2020).
איצט ווערן פארשידענע מעטאדן ווי מאמאגראפיע, מאגנעטישע רעזאנאנס בילדגעבונג (MRI) און אולטרסאונד גענוצט צו דיאגנאזירן TNBC. אבער, די מעטאדן האבן געוויסע באגרענעצונגען. מאמאגראפיע ווערט גענוצט צו דיאגנאזירן לאקאלע ברוסט געוועבן אנשטאט מעטאסטאזן, וואו קענסער צעלן האבן זיך אריבערגעצויגן צו אנדערע ארגאנען. אולטרסאונד איז נישט קיין פארלעסלעכער מעטאד פאר דיאגנאזירן TNBC (טשען און לי-פעלקער, 2023). MRI האט העכערע סענסיטיוויטי ווי אולטרסאונד און מאמאגראפיע, אבער איר דיאגנאסטישע גענויקייט איז באגרענעצט (שא און טשען, 2022). געוועב ביאפסיע איז אן אינוואזיווער וועג צו אידענטיפיצירן קענסער צעלן. אבער, אין געוויסע פעלער, קען א ביאפסיע פארפאסן קענסערישע געוועבן אויב די נאָדל גייט אוועק פון דעם געגנט פון אינטערעסע. דערצו, איז עס זייער טייער און קען זיין טראַוומאַטיש פארן פאציענט. TNBC איז א העטעראגענער טיפ קענסער, אזוי קען א ביאפסיע נישט צושטעלן גענוג אינפארמאציע וועגן דעם טיפ קענסער. דעריבער, איז א נייע דיאגנאסטישע פארלעסלעכע מעטאד פאר דעטעקטירן TNBC דרינגענד נויטיג. CRISPR/Cas9 קען דינען אלס א העכסט סענסיטיווע און מינימאל אינוואזיווע אלטערנאטיוו פאר ברוסט קענסער דיאגנאז. צו דעם צוועק, קענען CRISPR/Cas9-באזירטע סטראַטעגיעס גענוצט ווערן צו פֿאַרבעסערן PCR מעטאָדן פֿאַר דער דיאַגנאָז פֿון TNBC. ערשטנס, די Cas9 און cpf1 פּראָטעאינען פֿון דער CRISPR סיסטעם ווערן גענוצט צו באַזײַטיקן נישט-ספּעציפֿישע DNA, און דערנאָך קענען די צוויי פּראָטעאינען (Cas9 און cpf1) דערקענען די PAM סיקוואַנס איידער זיי בינדן זיך צום ציל DNA (Deepak Singh et al., 2021). אזוי, קען PCR אידענטיפֿיצירן מוטאַציעס פֿאַרבונדן מיט ראַק אַנטוויקלונג. עטלעכע שטודיעס האָבן אנגענומען די CRISPR-באזירטע סטראַטעגיע צו דעטעקטירן פֿאַרשידענע מוטאַציעס אין פֿאַרשידענע ראַקס (Safari et al., 2019). אזוי, קענען CRISPR-באזירטע PCR מעטאָדן רעדוצירן די אָפּהענגיקייט פֿון TNBC דיאַגנאָז אויף ינווײַזיווע מעטאָדן ווי ביאָפּסי-באזירטע אימונאָכיסטאָכעמיע.
גענאָטיפּישע ענדערונגען אין האָרמאָן רעצעפּטאָר רעגולאַציע זענען אויך דעמאַנסטרירט געוואָרן אין TNBC (טשען און רוסאָ, 2009). CRISPR/Cas9-באַזירטע PCR סטראַטעגיעס ניצן מיקראָרעיז פֿאַר פּונקט-פון-קער דיאַגנאָסטיק קענען עפֿעקטיוו מאָניטאָרירן די מוטאַציעס (האַדזשיאַן עט על., 2019). עס קען אויך צושטעלן געזונטהייט פּראַוויידערז מיט באַטייַטיק אינפֿאָרמאַציע וועגן ספּעציפֿישע מוטאַציעס אין TNBC פּאַטיענץ, וואָס קען העלפֿן פֿאַרבעסערן זייער באַהאַנדלונג קורס. אָבער, דעם קאַמביינד טעכניק האט לימיטיישאַנז. דעריבער, ברייט פאָרשונג השתדלות זענען פארלאנגט איידער דעם CRISPR/Cas-PCR אופֿן קענען זיין געניצט אין געזונטהייט פֿאַר די דיאַגנאָסיס פון TNBC (יאַנג עט על., 2019).